メディシノバ『MN-166(イブジラスト)のARDS動物モデルスタディ(Med Sci Monit、2020; 26:e922281)の解説【肺組織におけるアポトーシス編】』

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<本文は「Ibudilast, a Phosphodiesterase-4 Inhibitor, Ameliorates Acute Respiratory Distress Syndrome in Neonatal Mice by Alleviating Inflammation and Apoptosis(Med Sci Monit、2020; 26:e922281)」の解説記事となります。>

 

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メディシノバ『MN-166(イブジラスト)のARDS動物モデルスタディ(Med Sci Monit、2020; 26:e922281)の解説【スタディ方法編】』

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<本文>

4.肺組織におけるアポトーシス

図表4では、LPS誘発ARDSマウスにおける、A:細胞アポトーシスの検出、B:細胞アポトーシス因子であるBcl2・Bax・Cleaved caspase3・Caspase3、およびGAPDHの発現水準の分析を表しています。

 

A:アポトーシスの検出

TUNEL法により肺組織のアポトーシスを検出しています。

アポトーシスとは、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる、管理・調節された細胞死を意味します。肌のターンオーバーもアポトーシスによって引き起こされます。

TUNEL法は、アポトーシスを起こした細胞の断片化DNAを染色し、蛍光顕微鏡などで検出する方法です。

図表4のAでは各グループ(Normal・LPS・LPS+IBU 3.75mg/kg・LPS+IBU 7.5mg/kg)のアポトーシスの発生をそれぞれ見ています。

アポトーシスの発生が多く検出されると、それだけ細胞死を引き起こしていることに繋がります。

結果として、視覚的に「LPS投与」グループでは肺組織の炎症により細胞死が活発に起こっている事がわかり、「LPS投与+イブジラスト3.75mg / kg」グループと「LPS投与+イブジラスト7.5mg / kg」グループでは、「LPS投与」グループに対してアポトーシスの発生を抑制されました。

 

B:アポトーシス因子の発現水準の分析

図表4のBでは、ウェスタンブロッティングによるLPS誘発ARDSマウスにおけるアポトーシス因子のBcl2・Bax・Cleaved caspase3・Caspase3、およびGAPDHの発現水準の分析を表しています。

<アポトーシス因子>

・Bcl2:アポトーシスを抑制する働きを持つ。
・Bax:細胞をアポトーシスに誘導する働きを持つ。
・Cleaved caspase3:活性中のCaspase3のこと。
・Caspase3:アポトーシスを実行に移す働きを持つ。

本スタディではアポトーシスに関わる因子として、抗アポトーシスのBcl2、アポトーシス誘導のBax、アポトーシス実行タンパク質のCaspase3、そして、アポトーシス実行のために活性しているCleaved caspase3を選択しています。

同分析はウェスタンブロッティングにより、ターゲットとなる物質を膜に転写することで、アポトーシス因子(Bcl2・Bax・Cleaved caspase3・Caspase3)とGAPDHを検出しています。検出し視覚化されたものが左で、数値化されたものが右となります。

そして左部から、抗アポトーシスのBclの量が「健康体」グループにおいて最も多く(濃く)、「LPS投与」グループが最も少ない(薄い)ことが分かります。

反対に、アポトーシス誘導のBax、アポトーシス実行のために活性しているCleaved caspase3においては、「健康体」グループにおいて最も少なく(薄く)、「LPS投与」グループが最も多い(濃い)ことが分かります。

アポトーシス実行タンパク質のCaspase3、そして、GAPDHはどのグループにおいても変化が見られませんでした。

Caspase3はそもそも存在自体はアポトーシスを実行しません。活性化して始めてアポトーシスを実行するためです。そのため、各グループにおいて変化がないことは至って普通のことです。

GAPDHに変化がないことは「1.肺水腫」「2.血清および肺組織における炎症性サイトカイン」「3.肺組織におけるケモカイン」と同様に、イブジラストがGAPDH量の抑制に効果が発揮されていないのではなく、そもそもLPS投与による肺炎にGAPDHが関わっていない(GAPDHの量が増加しない)ことも考えられます。

しかし、残念ながら同スタディではその理由までは考察されていません。

図表4右部は検出されたアポトーシス因子(Bcl2・Bax・Cleaved caspase3)の発現量を数値化し統計解析をしたものです。

まず、「健康体」グループと「LPS投与」グループにおいて、LPSを投与した場合にしっかりとBcl2が減少し、Bax・Cleaved caspase3が増加しているかを解析しています。

LPSを投与したマウスは、Bcl2:約0.6倍に減少、Bax:約2.5倍、Cleaved caspase3:約4.2倍に増加することが立証されました(全てにおいて p < 0.001)。

その上で、「LPS投与」グループと「LPS投与+イブジラスト3.75mg / kg」グループおよび「LPS投与+ イブジラスト7.5mg / kg」を統計解析することで、イブジラストがBcl2を増加、Bax・Cleaved caspase3を減少させるかどうかを検証しています。

その結果、「LPS投与+イブジラスト3.75mg / kg」グループでは「LPS投与」グループに対して、Bcl2:約10%(p < 0.05)増加、Bax:約10%(p < 0.05)抑制、Cleaved caspase3:約25%(p < 0.01)抑制の効果が得られました。

「LPS投与+ イブジラスト7.5mg / kg」グループでは「LPS投与+イブジラスト3.75mg / kg」グループよりもさらに効果が見られ、Bcl2:約25%(p < 0.01)増加、Bax:約40%(p < 0.001)抑制、Cleaved caspase3:約50%(p < 0.001)抑制の効果が得られました

以上、A、Bより、イブジラストは、(A)肺組織におけるアポトーシスを抑制し、その根拠として、(B)抗アポトーシス減少の抑制およびアポトーシス誘導物質の増加の抑制に効果を発揮しています。

 

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